绿潮(green tide)是指由石莼属和浒苔属等海洋大型绿藻大量增殖或聚集所成的一种有害藻华[1]。世界上很多地区已经报道了绿潮现象,包括欧洲、美洲、澳洲和亚洲地区[2- 10]。我国黄海绿潮是目前世界上发生规模最大的绿潮灾害。2007年6 月,在我国南黄海局部海域首次观察到大型绿藻形成的绿潮现象,但绿潮规模不大,影响区域较小;其后自2008年以来,我国黄海海域连年暴发大规模的浒苔绿潮,每年5—8月周期性暴发与消亡,最大分布面积超过5万km2,已发展为我国一种较为普遍的海洋灾害。
绿潮灾害一旦产生,对黄海沿岸地区景观、环境和养殖业构成了持续威胁。绿潮海藻腐烂之后会导致水体缺氧、产生很多有毒的次生产物[11],导致大量水生生物死亡,并使得生物物种的多样性、丰度和总生物量减少,种群结构被改变,对沿海的生态系统造成严重威胁[2,12- 14];藻体覆盖海水表面,削弱穿透进入海水的光强[15];随着汹涌的海浪冲击,大量绿潮藻堆积到海岸上,会导致海岸的美观性受到影响,从而冲击旅游业的发展。
在黄海海域连年持续大规模暴发的绿潮藻种基本上都是绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属的浒苔(Ulva prolifera)[5,16]。浒苔属于广盐、广温性海藻[4],但是其生长所需的盐度与温度都有一定的范畴。浒苔在合适的生长环境中,因为具备得天独厚的优势,所以和其他海藻竞争营养盐占据上风,能够缩短繁殖时间,促进藻类大规模快速生长,从而产生规模较大的浒苔绿潮。
针对青岛近岸海域中规模较大的浒苔绿潮,需要密切监测它们的增殖情况、健康情况、生长情况。藻体最大光量子产量数值能够反映出藻类光合作用与生长受到外界因素的影响情况[17- 18]。而且,藻体叶绿素荧光测定不会对藻体造成任何损害,非常快捷方便。本研究期望借助监测漂浮浒苔藻体Fv/Fm光合生理参数的方法[19],即时监测和判断青岛海域漂浮藻体健康程度及生长活力,筛选、验证并完善绿潮藻的健康评价方法,为浒苔绿潮监测和处置提供科学参考和技术支持。
2016年6—7月,自国家海洋局北海分局启动绿潮应急预案后,国家海洋局北海环境监测中心技术人员乘坐中国海监船,对青岛沿岸重点海域开展绿潮应急监测。重点监测漂浮绿潮分布区的北部、西部,适度关注距岸较近的漂浮浒苔密集分布区位置、范围。以青岛沿海东南方向的“浒苔通道”海域为重点监测范围,根据绿潮分布卫星解译图设置走航监测线,重点关注对青岛影响较大的35°N以北海域浒苔绿潮分布情况。监测船舶在航渡期间开展绿潮分布的走航监测和采样,及时测定和记录。监测项目包括绿潮藻颜色、分布情况、光合作用效率等。
2016年6月20日至7月12日,实验组人员乘坐中国海监船,对青岛浒苔漂浮区域进行了巡查,共设了40个漂浮浒苔采样站位(L1~ L40,6月L1 ~ L2站,7月L22~ L40站),各站位经纬度详见表1。在青岛海域进行监测过程中,捞取海上漂浮绿潮藻,每个站位采集漂浮浒苔共5个平行样。使用0. 22μm孔径滤膜过滤海水,对采集到的浒苔样品轻轻地进行清洗,使其表面的漂浮物、杂藻、泥巴、污水被清理干净,之后静置在过滤海水中,待下一步实验进行。
根据漂浮浒苔藻体颜色分类标准,将各站位采集的每个藻体平行样,挑选数根置于白瓷盘中,观察颜色并分类。
对所采的每个藻体平行样现场测定叶绿素荧光活性Fv/Fm,以评价藻体健康等级。使用Dual-PA M荧光仪测量对叶绿素荧光进行测量,具体方法可以参考王阳阳等[20]与汤文仲等[21]。测定前样品都要经充分暗适应5 min,测量过程由专业的Windows操作软件DualPA M控制,将测量光启动,当光信号平稳之后,将饱和脉冲键打开,把Fv/Fm予以记录。
国内学者通过研究发现,漂浮浒苔藻体在一般的环境中,生理状态会表现出一定的差异性,相对应地,叶绿素含量和Fv/Fm也不同[22]。曹佳春等[22]研究了黄海青岛海域漂浮绿潮藻浒苔的光合生理特性并进行状态等级评价。结合漂浮浒苔藻体的不同颜色,具体测定Fv/Fm,从而构建评价藻体健康程度的基本等级,初步将藻体分为了4个等级:Ⅰ级健康藻体、Ⅱ级亚健康藻体、Ⅲ级半健康藻体、Ⅳ级衰老藻体(表2)。依据上述等级划分,对所采样品进行漂浮绿潮藻浒苔藻体健康评价。
应用SPSS Statistics 17. 0分析软件和Excel对数据进行统计分析。回归分析、方差分析绿潮浒苔的叶绿素荧光活性Fv/Fm值,以P< 0. 05作为差异显著性水平,得到的全部数据都用平均值±标准误(X±SE)表示。采用Sigmaplot 10. 0和Excel作图。
监测过程中发现,青岛海域漂浮绿潮呈条带状或斑块状,且多为黄绿色或黄色,青岛海域藻体一般都是管状或囊状的,颜色为黄绿色或浅绿色,有些也表现出白色;藻体细胞多呈浅绿或黄绿色,且间隔增大,内部填充物缺失,部分细胞出现颗粒化。通过上述现象我们能够了解到,该海域的浒苔藻体已经趋于衰亡状态。
图1为青岛海域站6月L1~ L22共22个站位采样的漂浮藻体叶绿素荧光参数Fv/Fm。其中,绿潮浒苔藻体荧光参数Fv/Fm均值有10个站位超过了0. 40。其中,站位L2的Fv/Fm均值达到0. 62,为最高值;其次是L1、L4、L6、L15、L19、L20、L21、L22,均值在0. 41~ 0. 59范围内;剩下站位的Fv/ Fm值均低于0. 40,站位12的Fv/Fm均值最低, 为0. 13。
图2为青岛海域站7月L23~ L40共18个站位采样的漂浮藻体叶绿素荧光参数Fv/Fm。其中, L23~ L26共4个站位的绿潮浒苔藻体荧光参数Fv/Fm均值都大于0. 40。站位L25的Fv/Fm均值为0. 6,达到最高;其次是L24、L25、L26的值,在0. 41~ 0. 59范畴内;L23的Fv/Fm均值为0. 40;其余站位的Fv/Fm均低于0. 40,站位40的Fv/Fm均值最低,为0. 08。与7月前期的L23~ L28各采样站位的Fv/Fm相比,之后的大多数采样站位的Fv/Fm均有显著下降(P<0. 01)。
根据藻体颜色,将6月L1~ L22共22个采样点的样品分类后,测定荧光参数Fv/Fm,根据曹佳春等[22]藻体状态评价体系,通过研究表明,青岛6月海域漂浮浒苔主要是Ⅱ级藻体、Ⅲ级藻体与Ⅳ级藻体,其中,Ⅲ级藻体与Ⅳ级藻体占比例更高(P< 0. 01)。占比例最高的是L2站位采样点的Ⅱ级藻体,高达60%,L15站位的Ⅲ级藻体所占比例最高的,达到100%(图3)。站位L2的藻体是亚健康状态,站位L1、L4、L6、L15、L19、L20、L21、L22的藻体为半健康藻体,余下各站位的藻体都表现出衰老的状态。
根据7月L23~ L40共18个采样点结合藻体的不同颜色,对Fv/Fm进行测定,研究表明,青岛海域7月漂浮浒苔可以评级为Ⅱ级藻体,Ⅲ级藻体与Ⅳ级藻体,主要是Ⅲ级藻体与Ⅳ级藻体(P< 0. 01)。L25站位采样点的Ⅱ级藻体所占比例最高,达到80%,L24站位采样点的Ⅲ级藻体所占比例最高,也达到80%(图4)。将以上荧光参数Fv/Fm结合藻体颜色观察结果,根据藻体状态评价系统,站位L25的藻体是亚健康藻体,站位L24~ L26的藻体是半健康藻体,剩下站位全部都是衰老藻体。7月总体与6月相比,大多站位藻体光合能力降低,Ⅳ级藻体所占比例更高,上述研究说明青岛海域的绿潮浒苔藻体细胞与藻体已经处在趋于衰亡的状态。
6月样品中,Ⅱ级黄绿色亚健康藻体、Ⅲ级黄色半健康藻体Fv/Fm都比Ⅳ级衰亡藻体要显著高(P <0. 01)。Ⅱ级藻体的Fv/Fm变化并不显著,而Ⅲ级、Ⅳ级藻体的Fv/Fm变化则比较明显(图5)。7月样品中,Ⅳ衰亡藻体的总比例最高,占绝对优势。样品中Ⅱ级黄绿色亚健康藻体、Ⅲ级黄色半健康藻体Fv/Fm都比Ⅳ级衰亡藻体要显著高(P< 0. 01)。Ⅱ级、Ⅲ级藻体的Fv/Fm变化较小,而Ⅳ级藻体的Fv/Fm变化较大(图6)。
处于不同状态的浒苔藻体,其藻体活性不同,增殖潜力不同。在本研究过程中,利用藻体叶绿素荧光活性测定技术,根据野外实测的荧光参数的结果,结合观察漂浮浒苔在野外自然环境下的藻体颜色、细胞形态,判断其所处于的生理状态,从而评价藻体状态和增殖潜力。本研究中青岛海域浒苔藻体呈浅绿或黄绿色,也有部分藻体发白,海上漂浮藻体呈条带状或斑块状;藻体形态多为囊状或管状;藻体细胞多呈浅绿或黄绿色,且间隔增大,内部填充物缺失,部分细胞出现颗粒化,处于细胞凋亡状态,且少量藻体出现生殖细胞放散等现象。6月,漂浮浒苔藻体叶绿素荧光参数Fv/Fm测定结果中,约40. 90%的站位在0. 41~ 0. 59范围内,约54. 54%的站位均低于0. 4;7月,约77. 78%的站位均低于0. 40。7月总体与6月相比,大多站位藻体光合能力下降。6—7月,监测海域Ⅳ级藻体所占比例更高,其叶绿素荧光活性比Ⅱ级藻体与Ⅲ级藻体要明显低很多,相应的Fv/Fm也要比正常值低,最低值达到0. 08,基本无法进行光合作用。结合藻体颜色呈现出由浅绿色或黄绿色向白色转变的暴发末期特征,及藻体细胞显微观察结果,研究表明,青岛海域的绿潮浒苔藻体已经处在趋于衰亡的状态。
生长环境条件的变化可以影响绿潮藻的形态和生理状态,进一步导致暴发生物量的动态增长和减少,所以环境因子的变化也可能是导致青岛海域绿潮衰亡的主要原因。本研究中,笔者同时监测了调查海域的生态因子参数,包括水温、光照强度、盐度、p H值和营养盐等。适宜的温度和盐度是绿潮暴发的主要条件,也是绿潮持续时间较长、暴发规模大的原因之一。6月调查海域表层和10 m层温度的变化范围为16. 72℃~ 22. 31℃,平均值为19. 53℃;表层和10 m层盐度的变化范围为30. 17 ~ 31. 95,平均值为31. 52。7月调查海域表层和10 m层温度的变化范围为17. 82℃~ 28. 60℃,平均值为22. 82℃;表层和10 m层盐度的变化范围为29. 94~ 31. 82,平均值为31. 68。温度和盐度均处于浒苔藻体生长和孢子释放的适应范围内(温度: 15℃~ 30℃;盐度:16~ 40)[23]。可见,温度和盐度并不是青岛海域绿潮藻趋于衰亡的主要限制因素。
绿潮藻自身具有独特的特点,能够在很短的时间内吸收很多营养盐,从而扩增生物量,且相对于其他藻类而言,其繁殖方式具有多元化的特点,所以更具竞争性。在过去的研究中,相关专家一致认为海水富营养化是导致绿潮大规模暴发的根本原因,最显著的特点是,海水中营养盐的浓度持续升高,氮磷含量增加,它们均为绿潮藻快速扩增提供了条件[24- 25]。我国山东、江苏等沿海地区的养殖业规模不断扩大,海水中有很多营养盐,使得当地海水存在严重的富营养化情况,诱发了黄海绿潮产生。Liu等[26]研究之后指出,2008年大规模暴发的浒苔和苏北浅滩周边的浒苔是同源的,所以,江苏大规模栽培紫菜可能是导致绿潮暴发的主要原因。除此之外,盐度、温度、光照都可能导致绿潮大规模暴发。无论是对于盐度还是温度,绿潮藻都有极强的适应力,其会在适合的环境中,成为极具竞争优势的藻类,并且大规模生长繁殖。
大量研究表明,大型绿藻具有高比表面,呈现高营养吸收速率。处于生长期的绿潮浒苔需要更多的营养,而藻的生长速率通常是与它们储存营养物质的能力有关的,其需要依靠持续高水平的营养盐来维持暴发[27- 28]。目前研究显示南黄海海区为高营养盐区,陆源径流输入和黄海暖流携带的营养盐补充量要大于浮游植物的消耗量,丰富的营养盐保证了该区域浒苔的生长需要[29]。由此可见,充足的营养盐是绿潮发生的物质基础。本研究中的监测结果显示,与同期南黄海尤其苏北沿岸海域的营养盐数据资料相比,青岛海域的营养盐水平要低很多。经统计在青岛海域绿潮监测站位中,表层DIN和
含量超过一类海水水质标准的百分比分别达14. 29%和5. 71%。DIN和
的平均含量分别为7. 54μmol/L和0. 14μmol/L,营养盐含量要明显低于南黄海海区,尤其是沿岸海域的营养盐含量,更进一步证明了青岛海域的低营养水平不足以支撑绿潮大规模暴发。绿潮藻集中漂浮分布于青岛海域的时间大多为每年6—7月,是年度中气温较高的时段,日照时间长,推测绿潮藻漂移至海水透明度相对较高的青岛海域[30],长时间暴露在高温高光照的环境中,加之该海域低营养盐水平无法满足大量绿潮浒苔的营养需求,促使绿潮浒苔在该海域趋于衰亡,进入暴发末期。
对于植物体而言,最主要的生化反应就是光合作用,其能够促进植物的繁殖与生长,并且为植物储备源源不断的能量,所以推测绿潮浒苔的光合系统对海水表面不断变化的环境特征,有其本身的适应性。采集之后的藻体会受到多元化因素的胁迫,假如样品经过运输之后,在实验室中测定其荧光参数,其值和直接测定会有显著的差异。所以本次研究选择采集自然环境中的漂浮浒苔样本,并且使用叶绿素荧光技术直接在现场测定藻类光合生理参数,这种测定方法能够得到更真实准确的数据。根据藻体最大光量子产量发生变化的研究数据,能够说明藻类光合作用以及生长情况受到不同环境的影响[17]。测定藻体叶绿素荧光的方法不会对藻体造成任何的不良影响,而且快速、简单。通过研究表明,漂浮浒苔藻体在自然环境中的生理状态有所差异,健康等级较高的藻体具有较高的光合活性, Fv/Fm值也相应较高。因此,有很多数据都能够被充分利用,可通过不断的研究,促进浒苔藻体健康评价系统完善和进一步发展,明确黄海绿潮漂浮浒苔的光合作用特征在其生长竞争中取得优势地位的作用,为即时监测和判断漂浮浒苔藻体健康程度、生长活力及增殖潜力奠定基础。现阶段大部分研究表明,在一般情况下,绿藻的Fv/Fm在0. 70~ 0. 75范围内[31]。本次研究青岛海域浒苔藻体的Fv/Fm值大多比0. 60低,这说明青岛海域漂浮浒苔藻体的光合作用能力较弱。
国内外大量研究表明,当藻类处于剧烈变化的环境压力包括温度、光照、盐度、摄食动物等的胁迫时能相应产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)[32- 35]。为了保障自身能够应对外因的不良影响与威胁,藻类具备抗氧化能力,可以清除活性氧(Reactive Oxygene Species,ROS)自由基的抗逆保护体系。较高的抗氧化酶活性及抗氧化剂含量通常与藻体较强的抗逆能力相关[36]。当外界环境胁迫超过藻类自身的耐受限度时,体内的抗氧化系统不足以及时清除ROS,导致ROS在细胞内过量累积,往往会对植物体造成严重的氧化性损伤,引起脂膜过氧化,光合作用系统的破坏,一些关键酶的失活及DNA结构的损伤等[36- 37],使得平时的新陈代谢受到不良影响,甚至导致植物的衰亡。与高等植物相似,藻类主要通过体内的抗氧化系统来维持ROS产生和消除的动态平衡。Choo等[32]研究发现,对ROS耐受种的藻类比敏感种的抗氧化系统更为有效。因此,黄海漂浮浒苔的抗氧化活性这类指标也可以纳入绿潮监测与评价体系。
为评估绿潮藻生长状态、繁殖活力等,在2016年的绿潮船舶业务化监测中,我们采用了浒苔藻体的叶绿素荧光活性(Fv/Fm)这一参数,结合藻体颜色,即时监测和判断漂浮浒苔的藻体状态、健康程度及生长活力。这对于船舶监测的布设站位,判断绿潮预警等级以及组织力量进行浒苔打捞和防治工作具有重要的指导意义。然而,目前未能将光合作用要素与绿潮藻的相对生长率、生物量等建立较为明确的定量关系。因此,下一步应研究测定黄海漂浮浒苔的抗氧化能力,对抗氧化活性等指标加以论证,配合叶绿素荧光参数、叶绿素含量、相对生长率等指标的使用,对藻体健康状况、生物量以及增殖潜力进行全面评价和预测,确立更加完备的绿潮浒苔评价方法,使绿潮灾害的评估和预测更准确、更科学,这对于黄海浒苔绿潮大规模暴发的潜力评估及科学预测预警是非常关键的。
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